Парафинокисляющие микобактерии

Одной из наиболее интересных особенностей микобактерий является их способность разлагать такие химически инертные соединения, как углеводороды, содержащиеся в нефти.

Предельные углеводороды вследствие строения молекул не вступают в реакции присоединения, а в реакции замещения вступают лишь при высоких температурах и давлении. Такие углеводороды и названы парафинами, что означает "обладающий малым сродством".

В последнее время ученые многих стран мира занимаются изучением углеводородокисляющих микроорганизмов. Такой повышенный интерес к ним связан с тем, что с помощью подобных микроорганизмов открываются возможности получения технического белка и других ценных продуктов из непищевого сырья, а также борьбы с нефтяными загрязнениями биосферы.

Рис. 100. Спорообразование у Mycobact. hyalinum. (По Н. А. Красильникову.) Увел. X 3000: 1 - концентрация плазмы на отдельные участки-фрагменты; 2, 3 - уплотнение фрагментов и превращение их в споры; 4 - растворение оболочки клеток; 5 - зрелые споры

Лучистые грибки составляют основную массу микроорганизмов, способных усваивать углеводороды. Впервые углеводородокисляющие лучистые грибки были описаны голландским микробиологом Зенгеном, который обнаружил их в садовой почве, воде каналов и навозе. Для выделения этих микроорганизмов в чистую культуру Зенген применил простой, но эффективный метод. Он приготовил в колбах раствор минеральных солей, необходимых для развития микробных клеток. К этому раствору Зенген добавил парафин. В колбы со средой ученый внес комочки почвы. Поскольку парафин являлся единственным органическим веществом в среде, то в колбах развивались только те микроорганизмы, которые могли его усваивать. Таким методом Зенген в 1913 г. выделил 6 видов микобактерии, которые хорошо развивались на нефти или ее очищенных фракциях - бензине, парафиновом масле, твердом парафине.

Рис. 101. Культура Mycobact. ceroformans на среде с гексадеканом. Увел. X 20 000

Исследования Зенгена помогли понять, каким образом из каналов и рек постепенно исчезает нефть, оставленная судами. Ее разлагают микроорганизмы. Позднее парафинокисляющие лучистые грибки были найдены и другими исследователями в различных почвах, воде и иле водохранилищ; при этом чаще всего встречались микобактерии. Особенно богаты парафин-окисляющими микобактериями почвы и пластовые воды нефтеносных районов, а также почвы на территории гаражей, нефтеперерабатывающих заводов, стоянок сельскохозяйственных машин и т. д.

Рис. 102. Клетка Mycobact. ceroformans на среде с гексадеканом. Увел. X 30 000

Парафинокисляющие микобактерии характеризуются способностью легко разлагать углеводороды. Это свойство, как оказалось, присуще обширной группе микобактерий. Поэтому большая часть парафинокисляющих микобактерий была отнесена выделившими их исследователями к известным видам. Если суммировать эти данные, то мы увидим, что видовой состав парафинокисляющих микобактерий не слишком разнообразен и составляет примерно 20 видов. Наиболее часто встречаются Mycobact. lacticolum, Mycobact. flavum, Mycobact. rubrum, Mycobact. luteum, Mycobact. mucosum. Поскольку большая часть парафинокисляющих микобактерий принадлежит к известным видам, то строение их клеток типично для этих видов. Отличием является несколько меньший размер клеток культур, растущих на среде с парафином. Например, клетки Mycobact. lacticolum var. aliphaticum при росте на мясо-пептонном агаре имеют длину 3 - 4 мкм и толщину 0,8 - 1 мкм; на среде с парафином клетки этой же культуры мельче (длина 2 - 3 мкм и ширина 0,4 - 0,6 мкм).

Рис. 103. Культура Mycobact. paraffinicum. Соединение клеток при помощи выростов. Увел. X 2400

Кроме известных видов, ученые обнаружили и такие культуры, которые по своим свойствам не совпадали ни с одним из описанных. Например, был выделен новый вид - Mycobact. viridae. Эти микроорганизмы отличались от остальных тем, что росли только на среде с парафином и не развивались на обычно употребляемых питательных средах; кроме того, они образовывали ярко-зеленый пигмент. Описано два новых вида парафинокисляющих микобактерий - Mycobact. ceroformans и Mycobact. paraffinicum. Исследование клеток этих организмов с помощью электронного микроскопа показало, что они обладают интересными морфологическими особенностями, не найденными до сих пор у микобактерий других видов. Оказалось, что клетки Mycobact. ceroformans окружены гроздевидными образованиями, которые прикреплены к оболочке клетки и состоят из отдельных округлых гранул (рис. 101). Сама оболочка имеет неровную, бугристую поверхность, усеянную тонкими нитями. Из крупных бугров на поверхности клетки, очевидно, и происходит выделение гранулярного вещества (рис. 102), Причем подобные гроздевидные структуры отсутствуют, если клетки Mycobact. ceroformans выращены на среде без углеводородов.

Рис. 104. Скопление клеток Mycobact. paraffinicum, соединенных выростами. Увел. X 2400

Клетки Mycobact. paraffinicum обладают длинными нитевидными выростами, при помощи которых они соединяются между собой и образуют гроздевидные или розетковидные скопления (рис. 103). Эти выросты отходят, как правило, от боковых сторон палочковидных клеток. В обычном микроскопе они видны уже в молодой (8-часовой) культуре, в суточной культуре выростов становится больше. При помощи этих выростов клетки соединяются друг с другом, образуя крупные скопления, состоящие из многих десятков, а иногда и сотен клеток (рис. 104). В электронном микроскопе видно, что выросты от разных клеток, встречаясь, спирально закручиваются один вокруг другого, образуя узловатые стволы - утолщения (рис. 105). К этим утолщениям присоединяются все новые выросты от других клеток. В конце концов, образуются очень крупные корневидные структуры, толщина которых может превышать диаметр вегетативных клеток (рис. 106). Подобные структуры клетки Mycobact. paraffinicum образуют не только на среде с парафином, но и на других средах. Однако меньше всего их наблюдается при выращивании культуры на самой богатой питательными веществами среде - мясо-пептонном агаре.

Рис. 105. Отростки от разных клеток Mycobact. paraffinicum при встрече закручиваются вокруг друг друга. Увел. X 42 000

Роль этих структур в жизни клеток еще не выяснена. Возможно, при их помощи происходит обмен продуктами метаболизма отдельных клеток или осуществляется максимальный контакт с субстратом. Последнее обстоятельство для парафинокисляющей культуры чрезвычайно важно. Действительно, ведь углеводороды нерастворимы в воде. Несмотря на это, углеводородокисляющие микобактерии прекрасно развиваются в водной среде с парафином.

Рис. 106. Культура Mycobact. paraffinicum. Образование крупных корневидных структур. Увел. X 20 000

Как же осуществляется контакт между ними и субстратом? Оказалось, что клетки микобактерии прочно прикрепляются к каплям парафина, окружая их плотным слоем (рис. 107), и в этом процессе, по-видимому, определенную роль играют поверхностные клеточные структуры.

Постепенно парафин из капли "выедается", а слой клеток нарастает.

Рис. 107. Клетки Mycobact. ceroformans на каплях парафина. Увел. X 2300

Большинство парафинокисляющих микобактерии, кроме углеводородов, может использовать и другие субстраты - сахара, органические кислоты, высшие спирты, жиры и пр. Но среда с углеводородом является для микобактерий оптимальной. Очень немного таких культур, которые нормально растут и развиваются только на среде с углеводородом (или продуктами его окисления), а при переносе на среды с другими субстратами погибают. Такова, например, Mycobact. ceroformans. Химическое строение углеводородов очень разнообразно. Различают ациклические, алициклические и ароматические углеводороды. Ациклические углеводороды представляют собой соединения с открытой цепью углеродных атомов, не содержащие в молекулах колец, или циклов. Они могут быть предельными, или насыщенными (парафины), и непредельными (ненасыщенными), с двойными или тройными связями между атомами углерода. К алициклическим соединениям относят все вещества, содержащие кольца из углеродных атомов, кроме бензола и его производных. Наконец, к ароматическим углеводородам относятся вещества, имеющие в молекуле особую кольцевую группировку - бензольное ядро. И отношение углеводородокисляющих микобактерий к этим соединениям неодинаково.

Ациклические углеводороды окисляются микобактериями гораздо легче ароматических. Однако разные группы ациклических углеводородов окисляются лучистыми грибками также с разной интенсивностью. Газообразные углеводороды - метан, этан, пропан и бутан - используются многими микобактериями, но с отчетливо выраженной приспособленностью микроорганизма к одному определенному соединению. Так, известно несколько видов мико-бактерий, окисляющих только метан. Очень немногие лучистые грибки могут усваивать жидкие летучие углеводороды (от пентана до октана). Углеводороды с числом углеродных атомов от 12 до 18 наиболее доступны. Однако и к ним разные штаммы относятся неодинаково. Например, Mycobact. paraffinicum предпочитает углеводороды с цепочкой из 16 - 18 атомов углерода, a Mycobact. lacticolum var. aliphaticum - с цепочкой из 13 - 18 атомов. Все углеводороды с прямой цепью усваиваются микобактериями легче, чем с разветвленной; ненасыщенные легче насыщенных. Даже такие вещества, как асфальт, битумы, резина, каучук, разрушаются лучистыми грибками.

Mycobact. citreochromogenum, найденная в образцах подземных вод нефтеносных районов, окисляет различные ароматические углеводороды, но особенно хорошо нафталин. Этот микроорганизм разлагает также и парафины.

Механизм разложения углеводородов. Окисление углеводородов микобактериями представляет собой ряд ферментативных реакций, следующих одна за другой, конечным продуктом которых является жирная кислота - наиболее окисленное соединение:

Самым важным в этой цепи является первый этап - введение кислорода в молекулу углеводорода.

Первичное окисление парафинов микобактериями может идти двумя путями:

1) в окисляемую молекулу вводятся два атома кислорода, образуется гидроперекись, которая затем превращается в спирт:

2) в окисляемую молекулу вводится один атом кислорода, спирт образуется сразу:

Интенсивность окисления углеводорода зависит от того, насколько насыщена среда кислородом, т. е. от аэрации. Спирты и альдегиды являются промежуточными продуктами окисления углеводородов, в клетках они не накапливаются.

Конечный продукт окисления - кислоты. С помощью метода газожидкостной хроматографии было выявлено, что при окислении высокомолекулярных парафинов в клетках микобактерий обычно накапливаются жирные кислоты с таким же числом углеродных атомов, какое имел исходный углеводород. В меньшем количестве присутствуют кислоты, углеродные цепи которых укорочены на два углеродных фрагмента. Так, в клетках Mycobact. paraffinicum, окисляющей углеводород гексадекан С₁₆Н₃₄, содержатся следующие жирные кислоты: пальмитиновая С₁₆Н₃₂O₂ (74%), маргариновая С₁₄Н₂₈O₂ (18%), лауриновая С₁₂Н₂₄O₂ (6%) и каприновая С₁₀Н₂₀O₂ (2%).

Жирные кислоты в свободном состоянии содержатся в клетках в небольшом количестве. Часть их используется микобактериями на синтез клеточных жиров и жироподобных веществ - липидов. Другая часть жирных кислот расщепляется на низкомолекулярные вещества, использующиеся клеткой для построения белков, углеводов и других необходимых соединений.

Липиды парафинокисляющих микобактерий, как, впрочем, и других микроорганизмов, представляют собой производные жирных кислот - триглицериды, воск и ряд специфических соединений. Все это - вещества сложно-эфирной природы. Так, триглицериды, выделенные из клеток Mycobact. paraffinicum, окисляющей гексадекан, представляют собой эфиры глицерина и трех жирных кислот - пальмитиновой, маргариновой и лауриновой. Причем преобладает в этой смеси соединение, называемое трипальмитином.

Трипальмитин входит в состав многих природных жиров, в частности сливочного масла.

Воска - это тоже сложные эфиры, образованные высшими жирными кислотами и высшими спиртами. Некоторые виды парафинокисляющих микобактерий накапливают в клетках большое количество воска. Например, в культуре Mycobact. ceroformans при выращивании на среде с гексадеканом накапливается в больших количествах воск цетилпальмитат, который образуется из цетилового спирта и пальмитиновой кислоты.

Исследование липидов парафинокисляющих микобактерий помогает раскрыть механизм окисления углеводородов разными штаммами микобактерий.