Глава 6. Роль фитоалексинов в защитных механизмах

Как обсуждалось в предыдущей главе, факт существования фитоалексинов у растений по крайней мере нескольких семейств еще не доказывает их участия в защитных механизмах. Делаются попытки приписать эту функцию биологически активным молекулам, выделенным из живых организмов, но могут возникнуть серьезные сомнения относительно вовлечения таких молекул в сложные процессы, происходящие в живых тканях. Прежде чем перейти к обсуждению роли фитоалексинов в устойчивости к болезням и в процессах, контролирующих специализацию при паразитизме, постараемся разобраться в существе этих вопросов.

Дейли [53] подчеркивал, что необходима осторожность при обсуждении доказательств участия каждого антимикробного соединения, выделенного из растений, в формировании устойчивости к болезням. Так, желательно знать, имеется ли такое соединение в тех участках растений, где оно может контактировать с паразитирующей бактерией или грибом. Участки, в которых различные паразитирующие микроорганизмы прекращают рост в устойчивых тканях растений, были описаны в главе 3, но в литературе очень мало данных о локализации фитоалексинов в межклеточном пространстве, клеточной стенке, цитоплазме, органеллах и вакуолях живых клеток или об их передвижении внутри и вокруг мертвых клеток. Многие фитоалексины липофильны, и вполне законно спросить, имеются ли они в этих важных микроучастках в тканях растений не только в достаточной концентрации, но также и в соответствующей форме, чтобы воздействовать на рост паразитов. Необходимо также знать, накапливаются ли фитоалексины на соответствующих стадиях во время инфекции, индуцируя наблюдаемое прекращение роста паразита. Сомнение относительно правильности нашего представления о последовательности событий, происходящих во время инфекции и проявления устойчивости, возникло, когда было показано, что рост нескольких паразитических грибов в тканях растений можно остановить с помощью антибиотика, в результате чего растительные клетки погибают, а затем накапливаются фитоалексины [133]. При такой интерпретации фитоалексины должны быть следствием, а не причиной устойчивости. Роль фитоалексинов вызывает много вполне законных сомнений, так что необходимы самые тщательные эксперименты для проверки гипотезы о том, что фитоалексины останавливают рост паразитов в устойчивых paстениях.

Взаимосвязь между накоплением фитоалексинов и устойчивостью

Фитоалексины и болезни бобов

Проводились широкие исследования возможной poли фитоалексинов в проявлении устойчивости растений к авирулентным расам возбудителя антракноза Colletotrichum lindemuthianum. Фазеоллин накапливается в высоких концентрациях после развития в клетках реакции сверхчувствительности в ответ на проникновение гриба [14, 199]. Фазеоллин локализуется на ограниченных участках некротических тканей в местах инфекции, что было выявлено с помощью экстракции изолированных кусочков стебля, но присутствие его в некротических и (или) примыкающих к ним клетках не было выявлено. Если фазеоллин локализован только в некротических клетках, то его концентрация через шесты дней после инокуляции будет более 3000 мгк/мл, что значительно превышает концентрацию в 10 мкг/мл, при которой рост ростковых трубок паразита in vitro прекращается [14]. Однако, как указывалось в главе 5, возможно, что фазеоллин образуется в окружающих живых клетках. Фазеоллин накапливается в течение двух или трех дней после появления первых симптомов гибели клеток, что совпадает с периодом, когда отмечается замедление роста ростковых трубок гриба внутри некротических клеток [223]. Фазеоллин - не единственный фитоалексин, накапливающийся в сверхчувствительных тканях. Бейли [11] показал, что в это же время в значительных количествах образуются три других активных соединения. Следовательно, образование фитоалексина является отличительной чертой развития низкого типа инфекции и связано с ранним некрозом клеток растения-хозяина, что является первым очевидным признаком высокой степени несовместимости между грибом и хозяином.

Хотя имеется много оснований предполагать, что устойчивость связана с действием фитоалексинов боба на ростковые трубки, все-таки возможно, что они либо совсем не контактируют с ростковыми трубками, либо вступают в контакт слишком поздно, чтобы вызывать прекращение роста. Необходимы исследования по локализации фитоалексинов в клетках, однако пока не разработано никаких гистохимических или микроспектрофотометрических методов обнаружения этих соединений у боба. Определить, вызывают ли фитоалексины прекращение роста гриба в сверхчувствительных клетках, можно с помощью фитоалексин-толерантных форм или мутантов авирулентной расы гриба. Большое число спор дикого типа гриба или спор, подвергнутых действию мутагена, могут быть отобраны по их способности расти на культуральной среде в присутствии фитоалексинов боба. Фитоалексин-толерантные формы можно было бы затем культивировать отдельно и проверить на способность инфицировать устойчивые сорта боба. Следовало бы сосредоточить внимание на тех формах, которые сохранили способность вызывать реакцию сверхчувствительности и образование фитоалексина. Если фитоалексины обычно ответственны за прекращение роста в некротических клетках, распространение толерантных форм не должно быть ограничено этими клетками, они должны расти во всех тканях. Такой эксперимент еще не был проведен, но он мог бы служить непосредственной проверкой гипотезы о том, что фитоалексины определяют устойчивость к возбудителю антракноза у боба.

В противоположность развитию низкого типа инфекции гифы вирулентной расы Colletotrichum совместимы с восприимчивыми клетками растения-хозяина в течение по крайней мере нескольких дней. В это время они активно растут в клетках хозяина, не оказывая какого-либо вредного воздействия на протопласты [223]. При развитии высокого типа инфекции на этой фазе патогенеза фазеоллин не накапливается [14, 199]. Для понимания регуляции образования фитоалексинов в инфицированных растениях необходим анализ факторов, ответственных за это главное различие в накоплении фазеоллина при двух типах инфекции. Как указывалось в главе 5, необходимо исследовать четко проявляющуюся взаимосвязь между некрозом и образованием фитоалексина и рассмотреть возможное образование авирулентными генами несовместимости факторов, которые взаимодействуют с продуктами генов устойчивости, вызывая либо некроз, либо синтез фитоалексина как общую реакцию хозяина на специфическое узнавание.

Любая гипотеза, касающаяся молекулярных взаимодействий, которые определяют тип инфекции, должна принимать во внимание, во-первых, возможность развития ограниченных некротических повреждений и, во-вторых, возможность ограничения роста гриба в гипокотилях восприимчивых растений после некоторого периода совместимости между клетками растения-хозяина и внутриклеточными грифами. Длительность периода роста гриба, как было показано в двух независимых исследованиях, зависит от неизвестных внутренних факторов и условий окружающей среды. В гипокотиле, выращенном в темноте, гриб продолжал распространяться в некоторых инфицированных участках, но не в тех, где появлялись коричневые локальные повреждения. Рае [199] показал, что фитоалексины быстро накапливались там, где рост гриба был ограничен, однако их не было в тех местах, где гриб продолжал распространяться. Бейли [11] установил, что в гипокотиле, росшем на свету, развитие симптомов зависело от температуры. При 17°С гриб продолжал распространяться, весь гипокотиль загнивал, и при этом было обнаружено очень мало фитоалексина. При 25°С рост гриба был локализован там, где был впервые отмечен рост мицелия, причем в этих местах наблюдалось интенсивное покоричневение тканей и образование высоких концентраций фазеоллина и фазеоллинизофлавана. Эти факты указывают на то, что накопление фитоалексина влияет на распространение повреждений, препятствуя дальнейшему росту гриба. Мы пока не знаем, какие факторы контролируют образование фитоалексинов в местах инфекции, однако необходимо еще раз подчеркнуть наличие взаимосвязи между появлением некроза и накоплением фитоалексина. По данным Рае [199], фазеоллин можно обнаружить через 17-18 ч после появления некроза: из чего следует, что стимулом для образования фитоалексина в этом случае является продукт взаимодействия растения-хозяина и паразита и, возможно, мертвых клеток. Более того, он заметил, что количество накапливающегося фазеоллина гораздо больше зависит от площади поражения, чем от любого другого параметра.

Можно предположить, что неизвестный фактор мертвых клеток вызывает образование фазеоллина в живых клетках, примыкающих к поврежденному участку. Возможно, повышенная температура ускоряет гибель колонизованных гифами клеток хозяина и, таким образом, стимулирует образование фазеоллина. Другое предположение, о возможной метаболизации грибом фитоалексинов при пониженных температурах, выдвинул Бейли [11], и вскоре было показано, что Colletotrichum lindemuthianum обладает этой способностью [32], что будет рассмотрено ниже.

Интересно рассмотреть общую восприимчивость проростков боба к грибным заболеваниям в холодных почвах как свидетельство отключения защитной системы боба при низких температурах. Среди грибов, вызывающих заболевания проростков боба, можно назвать Rhizoctonia solani и Fusarium solani f. sp. phaseoli. Нет данных о влиянии температуры на метаболизм фитоалексина при заболеваниях, вызываемых этими грибами, однако известно, что фитоалексины начинают накапливаться при образовании локальных повреждений. Киевитон начинает появляться при 30°С в первичных повреждениях, вызванных Rhizoctonia solani, а затем накапливается в высоких концентрациях вместе с фазеоллином, по мере того как повреждения развиваются, становятся ограниченными и приобретают коричневую окраску [23]. Интересным отличительным признаком, имеющим место при сходных повреждениях, вызванных F. solani f. sp. phaseoli. является отсутствие киевитона, хотя фазеоллин по-прежнему накапливается [260]. Таким образом, во всех локальных повреждениях, вызванных тремя различными патогенами боба, встречается фазеоллин, но при инфекциях, вызванных Colletotrichum, наряду с ним присутствует фазеоллинизофлаван, а при инфекциях, вызванных Rizoctonia, - киевитон. Причины и значение этих различий в накоплении фитоалексинов в настоящее время неясны. Однако вполне вероятно, что накопление фитоалексина создает фунгицидную среду в локальных повреждениях, и возможно, что это наряду с другими факторами препятствует дальнейшему росту гриба в гипокотиле восприимчивых сортов боба при повышенной температуре.

Фитоалексины и устойчивость сои к Phytophthora

В ряде исследований изучалось изменение содержания фитоалексина в различных сортах сои после инфицирования гипокотилей расами 1 и 2 Phytophthora megasperma var. sojae. Инокулюмы мицелия помещали в маленькие ранки, расположенные в центральной части гипокотиля, и два дня спустя высокие типы инфекции характеризовались обширной гнилью гипокотиля, тогда как низкий - локальными красно-коричневыми повреждениями вокруг мест инокуляции.

Признаком развития обоих инфекционных типов было появление фитоалексина через 10-12 ч после инокуляции [122]. Накопление продолжалось еще 36 ч, однако с большей скоростью и до более высоких концентраций в области, где образовывались локальные повреждения. Это явление аналогично наблюдаемому у боба накоплению фитоалексина в ходе развития реакции сверхчувствительности или образования локальных повреждений и также указывает на возможное участие фитоалексина в ограничении роста гриба.

Основным отличием от развития заболевания у боба является раннее образование фитоалексина при высоких типах инфекции. Очевидно, в отличие от клеток боба, зараженных совместимыми расами Colletotrichum, клетки сои, будучи инфицированными совместимыми расами Phytophthora, начинают образовывать фитоалексин, прежде чем его накопление подавляется каким-то неизвестным процессом. Обусловлено ли это отличие способом инокуляции или природой взаимоотношений хозяина и паразита, пока неясно.

Интересные данные были получены при изучении продуктов метаболизма грибов, которые, будучи введенными в гипокотиль, стимулируют образование фитоалексина. Достаточно активны в этом отношении культуральные жидкости вирулентной и авирулентной рас [125], однако, по предварительным данным, продукты авирулентной расы особенно активны при введении в гипокотили устойчивых растений. При гель-фильтрации продуктов авирулентной расы была получена фракция, которая гораздо более активно стимулировала образование фитоалексина в устойчивых сортах, чем в восприимчивых. Этот вывод основан на немногочисленных данных, поэтому в настоящее время нельзя с уверенностью сказать, что гипотетический специфический индуктор или стимулятор образования фитоалексина найден.

Фитоалексины и устойчивость картофеля к Phytophthora

Роль фитоалексинов интенсивно изучалась и в других типах взаимоотношений хозяина и паразита, включая специфические взаимодействия между определенными сортами картофеля и различными физиологическими расами гриба Phytophthora infestans, вызывающего пятнистость. В ранних экспериментах Томияма и др. [254] установили, что инокуляция срезов клубней картофеля несовместимой расой вызывала реакцию сверхчувствительности и образование ришитина, тогда как при инфицировании совместимой расой удавалось обнаружить только следы ришитина в течение того периода времени, когда гифы росли в клетках, не вызывая видимых изменений [134]. Как и в опытах с бобами, не была выявлена локализация ришитина в сверхчувствительных или примыкающих к ним клетках, но если он присутствует в наибольших концентрациях в некротических клетках, это должно создавать в них фунгицидные условия. И снова, как в сверхчувствительных клетках боба, инфицированного Colletotrichum lindemuthianum, ростковые трубки Phytophthora infestans продолжали расти еще несколько часов после отмирания клеток картофеля, хотя и более медленно. Таким образом, последовательность событий (отмирание клеток хозяина и последующее прекращение роста гриба) в приведенных типах взаимоотношений хозяина и паразита противоположна той, о которой сообщал Кирали и др. [133]. Это согласуется с гипотезой о том, что и ришитин участвует в проявлении устойчивости у картофеля. Это было подтверждено работами Варнса, Куча и Уильямса [263] и Метлицкого и др. [176], которые установили, что фитуберин и любимин, как фитоалексины, образуются в сверхчувствительных тканях клубней.

Куч [139] установил, что проявление устойчивости связано с биосинтезом не только этих фунгицидных терпеноидных соединений, но и многих других терпеноидов.

Были предложены и другие интересные идеи, касающиеся того, каким образом вирулентные гифы воздействуют на клетки восприимчивых сортов картофеля, препятствуя образованию в них фитоалексинов. Прежде всего необходимо подчеркнуть, что образование фитоалексинов в клубнях картофеля является общей реакцией на многие воздействия [261], включая заражение не только Phytophthora infestans, но и другими грибами, а также обработку экстрактами мицелия вирулентных и авирулентных рас P. infestans. Эти экстракты стимулируют образование фитоалексина в клубнях многих сортов картофеля, включая и те, у которых нет так называемых R-генов устойчивости к пятнистости картофеля.

Однако рост гиф вирулентной расы не вызывал образование фитоалексина в восприимчивых клетках [261]. Более того, при предварительной инокуляции вирулентной расой P. infestans количество фитоалексина, который образовывался в ответ на инокуляцию клубней авирулентной расой, уменьшалось [262]. Поэтому было предположено, что вирулентные гифы подавляют в восприимчивых клубнях образование фитоалексина и сдвигают метаболизм в сторону синтеза соединений, не обладающих фунгицидными свойствами [139].

Метаболизация фитоалексинов грибами и ее значение в развитии болезни

Участие фитоалексинов в реакции сверхчувствительности и ограничении повреждений уже обсуждалось, но можно также рассмотреть их роль в развитии болезней, первым симптомом которых является локальное поражение, из которого активные формы паразита распространяются по всему растению. Возможно, простейшим заболеванием подобного типа является пятнистость листьев конского боба, вызываемая Botrytis sp. Следствием проникновения ростковых трубок гриба в эпидермальные клетки является некроз, приводящий к появлению небольшого коричневого пятна. Гриб В. cinerea ограничивается только этими небольшими повреждениями, а вирулентные изоляты В. fabae распространяются на примыкающие к ним живые клетки, предварительно убивая их [161]. Фитоалексины, виероновая кислота и виерон быстро накапливаются в некротических клетках эпидермиса и примыкающих к ним клетках в течение первых двух дней после инокуляции В. cinerea. Мансфилд и др. [163] с помощью методов микроспектрофотометрии показали, что фитоалексины образуются в живых клетках, расположенных рядом с некротическими. Авторы предположили, что виероновая кислота, возможно, обладает и фитотоксичным действием, т. е. она не только предотвращает развитие гиф, но и способствует гибели клеток растения-хозяина. Распространенное представление о том, что фитоалексины образуются и ограничивают рост ростковых трубок в первых же клетках, которые погибли в результате внедрения в них паразита, вполне правдоподобно, но требует дальнейшей проверки. Если именно виероновая кислота ограничивает развитие гриба, значит, некоторые мутанты В. cinerea, толерантные к ней, должны обладать способностью к распространению из мест, где произошло заражение, однако это пока не было показано экспериментально. В пользу гипотезы об определяющей роли виероновой кислоты в ограничении роста гриба свидетельствуют данные о том, что ее концентрация быстро падает, по мере того как В. fabae начинает распространяться из мест инфекции [162]. Снижение концентрации происходит прежде всего в местах инокуляции в то время, как виероновая кислота начинает накапливаться сначала вокруг поражений, а затем по мере развития гриба и в периферийных тканях. Со временем виероновая кислота сначала в пораженных местах, а затем и во всем листе превращается в свою восстановленную форму, которая обладает меньшей фунгицидной активностью, чем сам фитоалексин. Восстановление молекулы виероновой кислоты происходит по тройной связи и в кетогруппах [164], и можно почти с уверенностью сказать, что этот процесс стимулируется в листе грибом, так как он может осуществлять его и in vitro. С другой стороны, гриб В. cinerea, по-видимому, не обладает способностью восстанавливать виероновую кислоту. Таким образом, результаты этого исследования проливают свет на возможную роль виероновой кислоты в ограничении роста В. cinerea и указывают на то, что способность к восстановлению виероновой кислоты может существенно влиять на патогенность В. fabae. Использование в тестах на патогенность встречающихся в природе вариантов или индуцированных мутантов В. fabae, которые потеряли способность восстанавливать виероновую кислоту, должно помочь при непосредственной проверке правильности этой гипотезы.

Следующий интересный аспект этой работы касается механизма, с помощью которого пыльцевые зерна и выделения из них настолько повышают патогенность Botrytis cinerea, что он приобретает способность колонизовать листья конского боба, не уступая при этом В. fabae [38]. Несмотря на то, что виероновая кислота накапливается в листьях, колонизованных в присутствии пыльцы, в высоких концентрациях, ее фунгицидное действие не проявляется, по-видимому, благодаря выделениям из пыльцы [160]. Возможным механизмом действия этих выделений является предотвращение поглощения грибом виероновой кислоты [58], однако эта проблема требует дальнейших исследований. Хотя это явление, возможно, приводящее к трагическим последствиям в поле, когда цветение совпадает с другими условиями, благоприятствующими развитию болезней, еще не до конца изучено, можно предположить, что образование фитоалексина играет ключевую роль в обычном механизме защиты растений конского боба от Botrytis. spp.

Результаты, полученные при изучении патогенности В. fabae, убедительно свидетельствуют о важной роли преобразования грибами фитоалексинов в растениях. В других исследованиях также была выявлена способность патогенных грибов метаболизировать фитоалексины. Эти сведения важны для понимания механизмов патогенности.

Одно из этих исследований, касающееся метаболизма птерокарпаноида медикарпина, было начато с изучения различий между несколькими патогенами, вызывающими пятнистость листьев люцерны. Stemphylium botryosum и S. loti проникают в листья через устьица и образуют подустьичные пузырьки, из которых возникают межклеточные вторичные гифы, вызывающие некроз примыкающих клеток растения-хозяина. Гифы этих грибов развиваются внутри этих некротических клеток и вокруг них в большей и меньшей степени соответственно [102, 192]. В противоположность этому аппрессориям Нelminthosporium turcicum и Colletotrichum phomoides не удалось проникнуть дальше зоны некротических эпидермальных клеток, на поверхности которых они образовали аппрессории. В результате анализа фунгицидных свойств инфекционных капель, в которых находился Н. turcicum на листьях люцерны, был выделен и идентифицирован фитоалексин люцерны - медикарпин [233]. В предыдущих опытах было показано, что проросшие споры S. botryosum в отличие от Н. turcicum, вызывали исчезновение неидентифицированного фитоалексина in vitro [103]. В последующих исследованиях Хиггинс [105] обнаружил, что медикарпин образуется листьями люцерны в ответ на заражение любым возбудителем пятнистости листьев, но медикарпин не накапливается в инфекционных каплях, в которых находился S. botryosum. Медикарпин, по-видимому, метаболизируется S. botryosum в листьях люцерны, так как мицелий гриба в культуре нечувствителен к фитоалексину и может превращать его в веститол [104, 238]. Однако, как указывал Хиггинс [105], не представлялось возможным установить, где в некротических и примыкающих к ним клетках образуется и предположительно разрушается медикарпин, так как отсутствуют методы, позволяющие следить за этими процессами на микроучастках листьев, имеющих небольшие повреждения. Метаболическая детоксикация фазеоллина, по-видимому, происходит при инфицировании гипокотилей боба Fusarium solani f. sp. phaseoli, так как образующийся при этом оксифазеоллон очень легко обнаруживается [260], как и в том случае, когда фазеоллин добавляли к культуре гриба [96, 97].

Высокое содержание бензойной кислоты, проявляющей фунгицидные свойства, можно обнаружить в локальных повреждениях, вызванных Nectria galligena в незрелых яблоках, но, по мере того как гриб начинает распространяться в спелом фрукте, концентрация ее снижается [24]. Бензойная кислота не метаболизируется тканью яблок, а превращается грибом в n-оксибензойную и протокатеховую кислоты. Обладающая меньшей фунгицидной активностью n-оксибензойная кислота и протокатеховая кислота, которая еще менее активна, могут быть обнаружены в гниющей ткани [25]. В этой работе авторы предположили, что по мере снижения кислотности и увеличения содержания сахаров в созревающих плодах гриб приобретает способность метаболизировать бензойную кислоту, что снижает фунгицидные свойства среды и позволяет ему расти дальше.

Фитоалексин капсидиол быстро окисляется в гораздо менее активный капсенон изолятами Fusarium oxysporum как в культуре, так и в плоде перца, и этот процесс, по-видимому, играет важную роль в колонизации перца этим паразитом [242].

В противоположность этому быстрое распространение Aphanomyces euteiches в ткани гороха невозможно в настоящее время объяснить его толерантностью к фитоалексину пизатину или способностью метаболизировать его. Пуппке и Ван Эттен [188] показали, что гриб вызывает образование пизатина в концентрации, намного превышающей те, при которых его рост in vitro прекращается, и тем не менее продолжает распространяться. Снижение уровня содержания пизатина наблюдалось на поздних стадиях развития поражения, но оно было не настолько велико, чтобы объяснить на его основе тот факт, что гриб, чувствительный к пизатину, хорошо растет в среде, богатой им.

Опыты по изучению метаболизма птерокарпаноидных фитоалексинов in vitro часто предшествовали получению данных о том, что они метаболизируются патогенами в растениях. Так были выявлены три различных метаболических пути превращения фазеоллина. Stemphylium botryosum превращает фазеоллин в аналогичный изофлавану фазеоллинизофлаван [93, 106]. Colletotrichum tindemuthianum окисляет фазеоллин в оксифазеоллин [32], тогда как Fusarium solani f. sp. phaseoli осуществляет его гидроксилирование до оксифазеоллона [97]. По-видимому, один и тот же фермент Stemphylium botriosum может осуществлять сходные превращения фазеоллина, медикарпина и мааккиаина в соответствующий 2'-оксиизофлаван [101], поскольку в суспензии спор ферментную систему для превращения одного из этих соединений можно было индуцировать любым из двух других. Однако выделить эту ферментную систему и проверить правильность высказанного предположения пока не удалось. В настоящее время все попытки выделить ферменты, ответственные за любые превращения фитоалексинов, оказались безуспешными, и только бесклеточный препарат, полученный из гриба leptosphaerulina briosiana, проявлял несомненную активность по отношению к медикарпину [100].

Фитоалексины и бактериальные болезни растений

Фитоалексины сначала рассматривали как фунгицидные вещества, однако нет никаких оснований полагать, что они не могут образовываться в растениях в ответ и на бактериальную инфекцию. Действительно, ряд явлений, связанных с устойчивостью к некоторым бактериальным патогенам, как обсуждалось в главах 3 и 4, можно было бы объяснить образованием бактериостатических веществ в ходе реакций сверхчувствительности. Самые первые исследования фитоалексинов не подтвердили это предположение, потому что образование пизатина в бобах гороха не стимулировалось бактериями [48], и пизатин не влиял на рост нескольких видов фитопатогенных бактерий в культуре [43]. Однако результаты опыта, проведенного недавно на других растениях, стимулировали дальнейшее изучение роли фитоалексинов в бактериальных инфекциях.

Было показано, что в ходе реакции сверхчувствительности листьев боба на внедрение Pseudomonas phaseolicola в них накапливался фазеоллин до концентрации порядка 200 мкг/г (в расчете на сырое вещество) [240]. Фазеоллин был неактивен против P. phaseolicola в жидкой культуре, но предполагалось, что антибактериальным действием могли обладать другие неизвестные тогда соединения, образующиеся в заметных количествах в сверхчувствительных тканях. Это предположение было подтверждено в работе Лиона и Вуда [151], которые показали, что экстракты листьев, аналогичным образом реагирующих на заражение, содержали шесть фракций, которые были активными по отношению к Brevibacterium linens при проведении биопробы непосредственно на тонкослойной хроматограмме. Далее было обнаружено, что три из этих шести фракций были активны против P. phaseolicola. Активность самой важной из этих фракции приписывали куместролу, однако действующее начало двух других пока не идентифицировано. Хотя куместрол также накапливался в листьях с высоким типом инфекции на более поздних стадиях, его отсутствие в здоровых листьях и заметное накопление в течение первого дня развития низких типов инфекции указывают на то, что его роль, возможно, аналогична той, которую играет фитоалексин у боба.

Куместрол также вовлекался в реакцию сверхчувствительности листьев сои к Pseudomonas glicinea [126]. После заражения быстро накапливались не только куместрол, но и другие родственные соединения: даидзеин, сойягол и фитоалексин, переименованный недавно в глицеоллин (Кин, личное сообщение). Куместрол и особенно глицеоллин ингибировали рост бактериального патогена на агаровой среде. Это свойство и тот факт, что концентрации этих двух соединений в листьях боба резко возрастали, прежде чем размножение бактерий было приостановлено, служат основанием рассматривать эти вещества как антибактериальные фитоалексины.

Терпеноидные фитоалексины ришитин и фитуберин образуются в клубнях картофеля после инокуляции Erwinia carotovora [152], и ришитин в отличие от фитуберина ингибировал рост бактерий в культуре [153]. Ришитин оказывал также бактерицидное действие на организмы, суспендированные в пептонной воде - среде, используемой для поддержания жизнеспособности бактерий без увеличения их численности. Хотя ришитин может способствовать устойчивости клубней картофеля к мягкой бактериальной гнили, у различных сортов не было найдено никакой корреляции между концентрацией ришитина и степенью устойчивости [154]. Необходимо дальнейшее исследование концентрации и локализации ришитина в загнивающей ткани и примыкающих к ней участках, чтобы выяснить, какое количество ришитина может вступать в контакт с бактериями in vivo.

Терпеноидный фитоалексин капсидиол также был выделен из плодов перца, инфицированного Erwinia carotovora [268], но в этом случае с помощью тестов на агаризованных и жидких средах не удалось получить никаких признаков антибактериальной активности.

Заключение

Тщательно были проверены и подтверждены данные о том, что накопление фитоалексина у многочисленных представителей семейств бобовых и пасленовых ответственно за ингибирование роста грибов или бактерий в сверхчувствительных тканях и локальных повреждениях. Необходима дальнейшая работа по изучению клеточной локализации фитоалексинов в связи с инфицирующими организмами, а гипотезу о том, что фитоалексины определяют устойчивость, можно проверить с помощью фитоалексин-толерантных видов или мутантов. Остается еще найти факторы, обусловливающие накопление фитоалексинов на ранней стадии развития низких типов инфекции в отличие от высоких. Экспериментальной проверки требуют два спорных предположения: либо что авирулентные паразиты специфически индуцируют образование фитоалексина и, возможно, связанный с этим некроз в устойчивых клетках растения-хозяина, либо что вирулентные паразиты специфически подавляют образование фитоалексина и, возможно, связанный с этим быстрый некроз в восприимчивых клетках.

Специализация некротрофных паразитов может идти по пути эволюции ферментных систем, осуществляющих деградацию фитоалексинов, накапливающихся на ранней стадии патогенеза. Обсуждалось несколько примеров подобного типа. Эта гипотеза может быть проверена путем использования вариантов или мутантов, обладающих специфичной энзиматической активностью или не обладающих ей.