Свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы. Азотобактер (Azotobacter)

В 1901 году Бейеринк выделил из почвы аэробную неспорообразующую грамотрица-тельную бактерию, фиксирующую молекулярный азот, и назвал ее Azotobacter chroococcum (в родовом названии отражена способность бактерии фиксировать азот, в видовом - способность синтезировать коричневый пигмент - chroo и образовывать кокковидные клетки - coccum). Азотобактер - типичный представитель свободноживущих микроорганизмов. Свободноживущие - это все те микроорганизмы, которые живут в почве независимо от того, развивается вблизи растение или нет.

Рис. 174. Фимбриоподобные образования у клеток азотобактера. Увел. X 24 000. (По Э. В. Болтянской.)

Культуры азотобактера в лабораторных условиях отличаются полиморфизмом. Клетки разных видов азотобактера в молодом возрасте показаны на рисунке 172. Молодые клетки азотобактера подвижны; они имеют многочисленные или единичные жгутики (рис. 173). У азотобактера обнаружены выросты, подобные фимбриям (рис. 174). В старых культурах клетки азотобактера покрываются плотной оболочкой, образуя цисты. Они могут прорастать, давая начало молодым клеткам (рис. 175).

Рис. 175. Цисты азотобактера (по Й. Чану и др.). Зрелая циста, наполненная гранулами жира и окруженная толстой плотной оболочкой (справа), и прорастающая циста (растущая молодая клетка разрывает оболочку цисты - слева). Увел. X 35 000

Полиморфизм азотобактера зависит в значительной степени от состава среды, на которой он выращивается. На среде с этиловым спиртом (в качестве единственного источника углерода) азотобактер длительное время сохраняет подвижность и форму палочек. В то же время на многих других средах полиморфизм проявляется очень резко.

Рис. 176. Развитие колоний A. chroococcum вокруг комочков почвы на безазотной среде

На плотных питательных средах, не содержащих азота, азотобактер образует крупные слизистые, иногда морщинистые колонии (рис. 176), окрашивающиеся при старении в желтовато-зеленоватый, розовый или коричнево-черный цвет. Колониям разных видов азотобактера присуща своя специфическая пигментация.

К настоящему времени известен ряд видов азотобактера: Azotobacter chroococcum, Az. beijerinckii, Az. vinelandii, Az. agilis, Az. nigricans, Az. galophilum.

Источником азота для азотобактера могут служить разнообразные минеральные (соли аммония, азотной и азотистой кислот) и органические (мочевина, различные аминокислоты) соединения. Однако если азотобактер развивается только за счет связанного в среде азота, он не выполняет своей основной функции - фиксации молекулярного азота. Азотобактер обычно фиксирует до 10 - 15 мг молекулярного азота на 1 г использованного источника углерода (например, глюкозы, сахарозы). Эта величина сильно колеблется в зависимости от условий выращивания культуры, состава питательной среды, ее кислотности, температуры, аэрации.

По отношению к источникам углерода В. Л. Омелянский (1923) назвал азотобактер полифагом ("всеядным").

Азотобактер хорошо усваивает разнообразные углеводы (моно- и дисахара, некоторые полисахариды), органические кислоты, многоатомные спирты (глицерин, маннит) и другие вещества.

Многим исследователям удавалось выращивать азотобактер в чашках с питательной средой без азота и углерода, если чашки были помещены в камеру, где находились пары ацетона, этилового спирта или некоторых других органических соединений. В присутствии легкодоступных форм углеродсодержащих соединений азотобактер может частично использовать углекислоту из атмосферы. Повышение концентрации углекислого газа до 0,5% в воздухе несколько стимулирует развитие азотобактера. Но азотобактером лучше усваиваются легкодоступные формы углеродсодержащих органических соединений. В почве запас подвижного органического вещества невелик, поэтому именно недостаток легкодоступных соединений углерода в первую очередь ограничивает развитие азотобактера в природных условиях.

Какие же органические соединения может использовать в почве азотобактер? Перегнойные вещества почвы азотобактером практически не усваиваются. Поэтому в почвах, даже очень богатых перегноем, при отсутствии свежих органических остатков интенсивного размножения азотобактера не происходит.

Однако, если в почве имеются органические соединения и продукты распада растительных и животных клеток, азотобактер развивается хорошо. В частности, он усиленно размножается в почвах, удобренных соломой и соломистым навозом, а также в разнообразных компостах, содержащих целлюлозу. Азотобактер хорошо ассимилирует вещества, образующиеся при распаде целлюлозы.

Развитие азотобактера и фиксация им азота в значительной степени зависят от наличия в среде фосфора. Источником фосфора могут служить как органические, так и минеральные фосфорсодержащие соединения. Высокая чувствительность азотобактера к фосфору позволила разработать микробиологический метод определения потребности почв в фосфорных удобрениях.

В качестве тест-организма в этом методе используется азотобактер. Микробиологические методы определения потребности почвы в удобрении имеют ряд преимуществ перед химическими анализами, хотя, безусловно, уступают в точности.

Важную роль в обмене веществ азотобактера играет кальций. Этот элемент необходим азотобактеру при питании как молекулярным, так и аммонийным азотом (Г. Н. Зайцева, 1965). Недостаток кальция в среде приводит к сильной вакуолизации клеток и их вздутию.

Высокая чувствительность азотобактера к кальцию, так же как и к фосфору, используется для определения потребности почв в известковании.

Микроэлементы (молибден, бор, ванадий, железо, марганец) необходимы азотобактеру в первую очередь для осуществления процесса азотфиксации. Потребность в микроэлементах определяется в значительной степени геохимическими условиями существования азотобактера в почвах. Штаммы микроорганизма, выделенные из почв с высоким естественным содержанием того или иного микроэлемента, нуждаются, как правило, в более высоких концентрациях этих элементов.

Интересно, что радиоактивные элементы (радий, торий, уран) оказывают стимулирующий эффект на развитие азотобактера и процесс азотфиксации.

Азотобактер чрезвычайно чувствителен к реакции среды. Оптимальная для его развития область рН 7,2 - 8,2. Однако азотобактер способен развиваться и на средах с рН от 4,5 до 9,0; кислая реакция среды неблагоприятно действует на его развитие. Из кислых почв выделяются неактивные формы азотобактера, утратившие способность связывать молекулярный азот.

Большое влияние на развитие азотобактера оказывает влажность почвы. Клетки азотобактера имеют меньшее осмотическое давление, чем клетки грибов и актиномицетов; потребность во влаге аналогична потребности высших растений. Азотобактер распространен в пресных водоемах, илах, затопляемых рисовых полях, сточных водах, сильно увлажненных почвах, на водных растениях в прудах и водохранилищах. Это свидетельствует о его высокой степени гидрофильности. На основании высокой потребности во влаге почвенных форм азотобактера предполагается, что предки некоторых морских и почвенных видов азотобактера могли быть общими.

В отношении температуры азотобактер является типичным мезофильным организмом, с оптимумом развития около 25 - 30 °С. Понижение температуры азотобактер переносит хорошо, поэтому зимой даже в северных широтах численность его клеток в почве заметно не уменьшается.

Из биологических факторов, влияющих на развитие азотобактера, следует прежде всего отметить почвенные микроорганизмы. Они могут оказывать влияние на жизнедеятельность азотобактера в почве косвенно, изменяя, например, рН или окислительно-восстановительные условия, и непосредственно, вырабатывая питательные и биологически активные вещества. Так, активирующее влияние целлюлозоразрушающих и маслянокислых микроорганизмов на развитие азотобактера и его антагонистические отношения с представителями почвенной микрофлоры отмечали многие советские и зарубежные исследователи. Биоценоз микроорганизмов, формирующийся в условиях той или иной почвы, меняется в значительной степени под влиянием растительного покрова. И азотобактер как член биоценоза также зависит от этого фактора. С помощью метода радиоавтографии установлено, что при нанесении меченных по фосфору клеток азотобактера на семена зерновых культур клетки обычно концентрируются вокруг растущей корневой системы проростков.

Имеются, однако, данные, что клеток азотобактера в ризосфере растений очень мало. В самом лучшем случае (при полном отсутствии антагонистов и благоприятных окружающих условиях) их количество не превышает 1% от общего числа ризосферной микрофлоры.

Рис. 177. Колонии бейеринкии разных типов (гладкие и складчатые варианты): 1 - 4, 6 - 8, 10 - по Н. И. Гогорикидзе; 5, 9, 11 - по Дж. Бекингу

Культуры азотобактера, как правило, образуют значительное количество биологически активных веществ: витамины группы В, никотиновую и пантотеновую кислоты, биотин, гетероауксин и гиббереллин. Однако, несмотря на то что культуры азотобактера вырабатывают целую серию биологически активных веществ, внесение витаминов, гиббереллина и гетероауксина в среду ускоряет рост азотобактера. Реакция на дополнительное внесение витаминов в среду является индивидуальной особенностью штаммов.

Азотобактер может продуцировать ростовые вещества типа ауксинов. Это подтверждается опытами, в которых было установлено образование дополнительных корешков у черенков фасоли под влиянием ауксинов, вырабатываемых азотобактером. Биологический тест - карликовая форма гороха сорта Пионер - позволяет определить в культуре азотобактера гиббереллиноподобные соединения.

Все эти соединения в совокупности способны стимулировать прорастание семян растений и ускорять их рост в тех, конечно, случаях, когда на корневой системе растений находится достаточное количество клеток азотобактера. Кроме того, была обнаружена антагонистическая активность азотобактера по отношению к возбудителям бактериальных болезней растений. Азотобактер синтезирует фунгистатический (задерживающий развитие грибов) антибиотик группы анисомицина. Ряд грибных организмов, встречающихся на семенах и в почве (виды из родов Fusarium, Alternaria, Penicillium), может угнетать развитие многих видов растений, особенно в холодную погоду. Азотобактер, продуцируя противогрибные антибиотические вещества, помогает растениям расти и развиваться, что имеет особенно большое значение в ранние фазы развития.

К сожалению, способность азотобактера активно размножаться в почве и проявлять свои многогранные качества весьма ограничена из-за дефицита легкодоступных органических веществ в почве и высокой требовательности микроорганизма к окружающим условиям. Поэтому стимулирующий эффект азотобактера проявляется лишь на плодородных почвах.

Распространение азотобактера в почвах Советского Союза имеет определенные закономерности. В целинных подзолах и дерново-подзолистых почвах, характеризующихся кислой реакцией, условия для развития азотобактера неблагоприятны. Только окультуривание таких почв создает возможности для его развития. В почвах с повышенным увлажнением и преобладанием луговой растительности (почвы пойм) азотобактер обычно встречается в течение всего вегетационного периода в больших количествах. В торфяниках азотобактер или отсутствует, или развивается очень слабо. В зоне достаточно увлажненных северных мощных черноземов азотобактер развивается хорошо, а в зоне обычных и южных черноземов при отсутствии орошения, а также в целинных и неполивных окультуренных каштановых почвах только как весенний эфемер. Максимальное развитие азотобактера в весенний период наблюдается и в целинных и в богарных почвах сероземной зоны. В солонцах и солончаках распространены преимущественно солестойкие расы азотобактера. В основном в почвах нашей страны доминирует Az. chroococcum.