1.8. Диагностика стойкости растений

Устойчивость растений к перенесению неблагоприятных условий обусловлена двумя принципиально различными механизмами. В одних случаях растение замедляет или прекращает рост, пассивно переживает неблагоприятный период и легко возобновляет процессы жизнедеятельности при прекращении стресса. В других случаях оно активно преодолевает неблагоприятные условия, обладая биохимическим аппаратом большой емкости и буферности, благодаря чему процессы жизнедеятельности в стрессовых условиях не нарушаются.

Растения, которые пассивно переносят неблагоприятные факторы среды, имеют меньшую оводненность тканей, более высокое содержание сухого вещества, в частности сахаров, более высокое осмотическое давление клеточного сока, меньшую проницаемость протоплазмы, большую стойкость к завяданию, ксероморфную структуру и как следствие - повышенную устойчивость. Эти показатели являются критериями стойкости.

Для определения устойчивости, связанной с активным преодолением неблагоприятных условий, используют более сложные методы: определение активности ферментов, интенсивности фотосинтеза, фотохимической активности хлоропластов, интенсивности и качества дыхательного метаболизма, содержания пролина, диамина (путресцина), полиаминов (спермидина, спермина), поглощения веществ и пр.

Устойчивость растения связана также с прочностью его мембран, хлорофилл-белково-липоидной связи, резистентностью ферментов фотосинтеза, дыхания, активностью антиоксидантной системы и др. Любой из этих показателей не может достаточно полно характеризовать устойчивость системы. Только комплекс данных показателей может свидетельствовать о резистентности растения. Разработка методов диагностики растений на устойчивость предполагает хорошее знание специфики действия неблагоприятных факторов и экологического типа исследуемого объекта.

Существуют быстрые методы диагностики устойчивости.

Плазматический метод. Срезы тканей помещают на 1 - 2 часа в 10%-ный раствор сахарозы. Отсутствие илазмолина свидетельствует о повреждении и гибели клеток.

Окрашивание. Раствор метиленового голубого (100 мг/л) в 2,5%-ном KH₂PO₄ через несколько минут окрашивает мертвые и нежизнеспособные клетки в синий цвет. Живые клетки окрашиваются значительно медленнее. При окрашивании акридиновым оранжевым (200 мг/л) через 5 - 10 мин. живые клетки флуоресцируют, зелено-желтым светом, а поврежденные и мертвые - оранжево-красным.

Метод Ф. Ф. Мацкова. Для определения жаростойкости клеток и тканей берут лист растения и выдерживают его на водяной бане при онеределенной температуре в течение 10 мин., затем лист вынимают и опускают на несколько минут в холодную воду, после чего погружают в 0,1M раствор соляной или азотной кислоты. Чем сильнее поврежден лист при нагревании, тем скорее и в большем числе появляются на нем бурые пятна - следствие образования феофитина при проникновении кислоты внутрь ткани. Время появления пятен и их число за единицу времени служат критерием большей или меньшей жароустойчивости клеток.

Метод В. Я. Александрова. Для определения устойчивости клеток к действию температурного фактора исследуют скорость движения протоплазмы. Для этого анализируют движение пластид или сферосом в клетках. При воздействии неблагоприятных факторов скорость движения протоплазмы замедляется.

Метод отращивания. Растения после стресса помещают в благоприятные условия и через одну-две недели визуально определяют их жизнеспособность.

В последнее время все большее внимание уделяется разработке биофизических методов оценки на устойчивость к экстремальным факторам среды. К наиболее перспективным относятся методы, основанные на регистрации характера биоэлектрических потенциалов, сверхслабого послесвечения, проницаемости клеточных мембран и др.

Диагностика по величине биоэлектрического потенциала. У мертвых тканей и органов биоэлектрический потенциал (БЭП) отсутствует, у поврежденных он обычно в десятки раз ниже нормы. В первые моменты повреждения возможно резкое возрастание БЭП вследствие появления так называемых раневых потенциалов. И. И. Гунаром было показано, что характерные особенности БЭП (амплитуда, длина волны, время наступления ответной реакции) могут служить критерием повреждения растительного объекта [17].

Диагностика по изменению проницаемости клеточных мембран. Неблагоприятные факторы внешней среды приводят к нарушению структуры мембран, что влечет за собой изменение их проницаемости. Об изменении проницаемости клеточных мембран судят по выходу электролитов из клеток и тканей в воду. Изменение скорости выхода электролитов коррелирует с изменением электропроводности водных растворов. В мертвых и поврежденных тканях проницаемость, измеренная по электропроводности водных растворов, резко увеличивается [54].

Диагностика холодостойкости. При низкой температуре происходит нарушение энергетического обмена и как следствие - торможение активного транспорта ионов из корней в надземные органы. Отделенную от растения корневую систему (или лист) ополаскивают водопроводной водой, слегка подсушивают, взвешивают и помещают в бюкс. Корни или листья заливают 20 мл кипящей бидистиллированной воды и оставляют на 30 мин. Затем растительную ткань удаляют, охлаждают раствор до комнатной температуры и определяют его электропроводность (ЭП). О содержании ионов в корнях и листьях судят по ЭП вытяжек из убитых кипячением тканей. Величина отношения содержания ионов в корнях к содержанию в листьях будет тем выше, чем менее холодостойко растение [21].

Диагностика по регистрации длительного послесвечения. Если лист растения осветить видимым светом, а затем поместить в темноту, то при помощи чувствительного детектора света (фотоэлектронного умножителя) можно обнаружить затухающее в течение нескольких минут свечение. Его называют длительным послесвечением (ДПС). Информационная ценность ДПС состоит в том, что с его помощью можно исследовать не только физико-химические механизмы превращения световой энергии в химическую, но и следить за состоянием этой системы клетки при действии на растение различных факторов. На основе явления ДПС разработаны методы экспресс-диагностики морозо- и жароустойчивости растений, исследуются реакции растений на нарушение водного режима, на засоление и др. [45].

Диагностика теплоустойчивости по изменению электрического сопротивления листьев. Листья прогревают при температуре 40 - 45°С и определяют изменение электрического сопротивления (ЭСП). Чем сильнее изменяется ЭСП листьев, тем менее жароустойчив сорт [50].

Диагностика теплоустойчивости по степени подавления фототаксиса хлоропластов. Степень подавления фототаксиса хлоропластов может быть использована как критерий устойчивости паренхимных клеток листа к различным повреждающим агентам и в том числе для оценки теплоустойчивости. Сравнивают интенсивность фототаксиса хлоропластов прогретых при определенной температуре и контрольных (непрогретых) листьев. Для этого их срезают накануне измерения и в течение ночи выдерживают во влажной камере при освещении около 100 лк (тенелюбивые виды) или около 500 лк (светолюбивые виды). После этого листья подвергают тестирующему нагреву. Затем дважды измеряют светопропускание при помощи селенового фотоэлемента, соединенного с чувствительным гальванометром, или обычного люксметра. Вначале проводят измерение сразу после действия неблагоприятного температурного фактора, а затем - после освещения сильным светом около 25 тыс. лк в течение 30 или 60 мин. Разность между вторым и первым измерениями светопропускания служит показателем интенсивности отрицательного фототаксиса хлоропластов. Можно измерять и обратную реакцию - уменьшение светопропускания листьев за счет положительного фототаксиса хлоропластов. В этом случае первый раз светопропускание поврежденных нагревом листьев измеряют после выдерживания их не менее 60 мин. на сильном свету. Затем листья помещают на 30 мин. на слабый свет, после чего светопропускание измеряют второй раз. Разница между первым и вторым измерениями светопропускания служит показателем интенсивности положительного фототаксиса хлоропластов. По интенсивности положительного и отрицательного фототаксиса можно судить об устойчивости клеток паренхимы листа к действию температурного фактора. Следует отметить, что не у всех растений фототаксис хлоропластов выражен достаточно четко [31].

Диагностика засухоустойчивости по определению водоудерживающей способности листьев и способности их переносить обезвоживание. Берут пробы листьев у исследуемых растений (одинаковых по возрасту и местоположению), раскладывают на металлические сетки или развешивают их в одинаковых условиях (в тени или в помещении). Водоудерживающую способность учитывают, периодически взвешивая листья через 2, 4, 8, 12, 24, 48 часов, а также по количеству оставшейся воды в них в конце завядания. Выявлена положительная корреляция между повышением водоудерживающей способности листьев и засухоустойчивостью растений. Для определения способности органов выносить обезвоживание, т. е. восостанавливать тургор, побеги и листья помещают на 3, 6, 12 часов в банки основаниями в воду, налитую слоем в 0,5 - 1,0 см. Банки сверху закрывают для создания влажной камеры. Листья можно также помещать между двумя слоями смоченной фильтровальной бумаги. У засухоустойчивых растений листья восстанавливают тургор, у незасухоустойчивых - буреют и остаются завядшими. Степень восстановления тургора учитывается но весу поглощенной воды [18].

Существуют и другие методы оценки засухоустойчивости [3; 12].

1. Во время засухи у засухоустойчивых растений синтетические процессы преобладают над гидролитическими. П. А. Генкель с сотрудниками предложил метод крахмальной пробы, а также микроскопические реакции на белок для оценки синтетической способности клеток в процессе завядания растений.

Для определения направления обмена веществ в полевых условиях было предложено использовать крахмальную пробу. В поле не раньше 11 - 12 часов дня, когда в листьях накопится достаточное количество крахмала, срывают листья определенного яруса и подвергают их завяданию в течение 2 - 3 часов. Затем, обесцвечивая лист спиртом, производят пробу на крахмал, действуя раствором йода в йодистом калии. Чем больше образуется крахмала, тем интенсивнее идет его синтез, тем засухоустойчивее растение. Четкие результаты получены для проса, подсолнечника, картофеля, менее четкие для пшеницы, так как у нее образуется мало крахмала.

2. Хорошим критерием устойчивости растений к засухе является степень изменения содержания хлорофиллов а и б, а также каротиноидов, связанных с липопротеидным комплексом пластид в процессе завядания. При изучении взаимосвязи между динамикой накопления пигментов, устойчивостью хлорофилл-белково-липидного комплекса и устойчивостью растений установлено, что у засухоустойчивых сортов содержание связанного хлорофилла в течение почти всего весенне-летнего периода больше, чем у неустойчивых.

3. Засуха южного типа проявляется при действии высоких температур, и для оценки засухоустойчивости часто используют метод Ф. Ф. Мацкова (см. выше).

Применение нескольких критериев диагностики позволяет надежно оценить засухоустойчивость растений. Диагностику общей устойчивости можно проводить по определению эффективности синтеза стрессовых белков [60; 63].

Растения подвергают стрессовым воздействиям и выдерживают в стерильных условиях на питательной среде, содержащей меченые аминокислоты (³⁵S-метионин 50 - 65 мкКи/мл или ³H-лейцин 22 - 50 мкКи/мл) в течение определенного времени. Затем объекты многократно промывают стерильной водой и раствором немеченой аминокислоты. Материал гомогенизируют при 2 - 4°С в трис-HCl буфере (50 - 65 мМ), содержащем 2% додецилсульфата, 2 b-меркаптоэтанола и 15% глицерина. Для определения интенсивности включения меченых аминокислот в растительные объекты на бумажные фильтры наносят определенные аликвоты гомогената и просчитывают радиоактивность. Гомогенат цетрифугируют при 12 тыс. об/мин., белок экстрагируют из супернатанта в двухфазной системе метанол - хлороформ (1:1) и двухкратно осаждают ацетоном. Осадок белка высушивают в вакууме, растворяют в определенном объеме 62,5 мМ трис-HCl буфера (pH-6,8), содержащем 10% глицерина, 5 β-меркантоэтанола, 2,3% додецилсульфата. Раствор белка прогревают 5 мин. на кипящей водяной бане до полного растворения белка. Для выявления белковых фракций, включающих радиоактивные метки, проводят одномерный электрофорез в градиенте концентрации полиакриламидного геля (ПААГ) в присутствии доде- цилсульфата натрия. Разделение белков ведут в линейном градиенте 10 - 20% акриламида. После электрофореза гели окрашивают кумасси G-250, обезвоживают ледяной уксусной кислотой, пропитывают 2,5-дифенилоксазолом, высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой РМ-В (или РМ-1С). Полученные флюорограммы сканируют на денситометре. Эффективность синтеза белков в стрессовых условиях рассчитывают по отношению включения меченой аминокислоты в очищенные фракции белка к величине поступления метки в растительные объекты и выражают в процентах.

В заключение следует отметить, что практика ведения сельского хозяйства показывает, что повышение продуктивности растений приводит к снижению устойчивости и качества урожая. Достижения последних лет в области физиологии, биохимической генетики могут быть использованы для прогнозирования уровня резистентности организмов и создания устойчивых и высокопродуктивных растительных форм.