Глава 2. События, предшествующие проникновению паразита в растение и сопровождающие этот процесс

Многие микроорганизмы переносятся на листья и стебли растений воздушными потоками или каплями дождя. Ряд грибов и бактерий перемещается к корням с почвенными водами либо находятся в покоящемся состоянии в почве до тех пор, пока корни не достигнут места их обитания. Растения могут физическими и химическими средствами оказывать влияние на находящиеся вокруг них микроорганизмы, начиная, таким образом, взаимодействие, за которым должно последовать внедрение паразита в растение, если паразитизм в принципе возможен. В этой главе мы узнаем, какие попытки были предприняты, чтобы оценить количественно роль первичных взаимодействий между потенциальными паразитами и хозяином в дальнейшем развитии паразитизма.

Влияние корней на паразитов в почве

В основном воздействие корней на находящиеся в почве организмы заключается в общей стимуляции их прорастания и роста, что особенно важно для паразитов, большинство из которых остается в состоянии покоя до контакта с живыми субстратами. Паразитические грибы находятся в почве в виде покоящихся форм или морфологических структур различного типа, таких, как склероции, ооспоры, хламидоспоры, базидиоспоры и фрагменты гиф. Считается, что их покой может быть двух типов - органический или экзогенный (вынужденный) [249]. Органический покой определяется у грибов внутренними факторами и особенно характерен для базидиоспор. Экспериментально органический покой по крайней мере небольшой части спор можно нарушить, подвергнув их температурному шоку или обработке некоторыми химическими веществами, а также поместив поблизости от других микроорганизмов или корней вегетирующих растений. По-видимому, изменение окружающих условий в почве способствует прорастанию некоторых спор в благоприятное время года. Вероятно, также, что корневые выделения вызывают прерывание покоя базидиоспор микоризных грибов [76]. Экзогенный покой обеспечивается внешними факторами в почве. Среди веществ, выделяемых другими обитателями почвы, прорастанию грибов препятствуют этилен [229, 230] и, возможно, антибиотики, многие из которых были открыты как продукты жизнедеятельности почвенных грибов и актиномицетов при выращивании их в культуре. Роль этих веществ в природных условиях пока неясна. Влияние некоторых факторов, препятствующих прорастанию грибов в почве, может быть преодолено благодаря действию веществ, стимулирующих этот процесс, которые диффундируют из корней растений, преимущественно из зоны их растяжения [216]. Это минеральные соли, сахара, аминокислоты, органические кислоты, нуклеотиды и витамины [207].

Много раз сообщалось о том, что корневые выделения обладают стимулирующим действием, но известно также, что в корнях имеются и токсичные факторы, такие, как цианогенный глюкозид линамарин у Linum [256] и соединения, ингибирующие рост нематод, у Asparagus [204] и Tagetes [274]. Эти вещества или их производные, обладающие бактерицидными свойствами, могут диффундировать в почве. Как будет обсуждаться ниже, роль таких ингибиторов во взаимодействиях между корнями и микроорганизмами-паразитами до их внедрения не совсем ясна, но Валлас [267] считает, что такие факторы могут влиять на нематод раньше, чем они достигнут корней некоторых растений, хотя, по его утверждению, устойчивость к нематодам обычно проявляется во время внедрения или после него.

В литературе пока мало данных, свидетельствующих о том, что корни восприимчивых растений оказывают исключительно стимулирующее действие на паразитические грибы в почве, а корни устойчивых растений - репрессивное. Как подчеркивают Скрот и Гильдебранд [216]), почва - это сложная среда, и стимуляторы и ингибиторы, диффундирующие из корней растений, очевидно, воздействуют на активность многих обитателей почвы, включая сапрофитных антагонистов, поэтому невозможно предсказать характер ее влияния на развитие паразитического организма. В ряде лабораторных экспериментов, в которых эти сложности были устранены, было показано, что корни восприимчивых растений стимулируют образование инфекционных структур, а корни устойчивых растений избирательно подавляют прорастание спор, но специфичность этих воздействий не была учтена в последующей работе. Так, Флентье [71] и Керр и Флентье [128] показали, что образование аппрессорий Pellicularia filatnentosa стимулировалось экссудатами из корней восприимчивых растений, но Флентье, Додман и Керр [72], де Сильва и Вуд [221] сделали вывод, что различие между растением-хозяином и посторонними растениями в этом отношении невелико. Бакстон [34] установил, что смывы с корней устойчивых сортов гороха Pisum sativum ингибировали прорастание конидий Fusarium oxysporum f. sp. pisi, а затем обнаружил, что сходное действие оказывают смывы с корней устойчивых сортов банана Musa sp., на прорастание конидий F. oxysporum f. sp. cubense [35]. Однако Коммедалю [137] не удалось показать специфичность влияния экссудатов из корней гороха на прорастание микроконидий или хламидоспор F. oxysporum f. sp. pisi. Более того, стерильные экссудаты из корней устойчивых и восприимчивых сортов одинаково стимулировали различные физиологические расы паразита in vitro, такое же действие наблюдалось, когда экссудаты диффундировали через пористые пластинки в почву, содержащую хламидоспоры [270]. Следовательно, имеется мало оснований полагать, что корни восприимчивых растений селективно способствуют прорастанию и хемотрофному росту вирулентных паразитов.

Притяжение зооспор отдельных Phytophthora spp., Aphanomyces euteiches, Olpidium spp. и Pythium aphanidermatum к различным корням в зоне их удлинения уже установлено и обсуждалось Хикманом и Хо [98]. Зооспоры двигаются по направлению к корням, прикрепляются и инцистируются на них. Водорастворимые экстракты, а также многие индивидуальные соединения, выделяющиеся, как известно, из корней, способствовали притяжению зооспор P. aphanidermatum [208, 209]. В этой работе только глутаминовая кислота в присутствии аммонийных оснований вызывала хемотаксис, прикрепление и инцистирование зооспор. Однако маловероятно, что только одна глутаминовая кислота может вызывать притяжение зооспор к корням. Троутман и Уиллс [257] обнаружили, что зооспоры Phytophthora parasitica двигались по направлению к отрицательным электродам и предположили, что электростатическая адгезия может происходить в зоне удлинения корней. В противоположность результатам большинства исследований, в которых изучали ответную реакцию зооспор на корни, Центмайер [282] отметил, что некоторые зооспоры специфически притягивались к корням растений- хозяев и не притягивались к корням непоражаемых растений. Зооспоры P. cinnamomi через несколько минут достигали корней восприимчивых сортов авокадо Persea americana, а инцистировались и прорастали в течение часа. К корням устойчивых сортов зооспоры этого гриба двигались менее активно и не притягивались к корням томата Lycopersicon esculentum, табака Nicotiana tabacum и Citrus sp. Подобным же образом зооспоры P. citrophthora притягивались к корням цитрусовых, но не к корням авокадо. В дальнейшей работе Хью и Центмайер [130] установили, что зооспоры пяти видов Phytophthora, включая P. cinnatnomi и P. citrophthora, проявляют хемотаксис ко многим соединениям, выделяющимся из корней. В противоположность данным, сообщавшимся Троутманом и Уиллсом [257], Хью и Центмайер [131] показали позднее, что зооспоры семи видов, включая P. parasitica, притягивались к положительным электродам, но не притягивались к отрицательным. Зная, что множество зооспор различных паразитов притягивается к корням неспецифично, трудно понять природу любого специфичного таксиса к корням восприимчивых растений.

Большинство данных, следовательно, дает основание предполагать неспецифическое стимулирование корнями растений активности почвенных микроорганизмов. В то же время есть несколько нуждающихся в подтверждении сообщений, что некоторые события, происходящие еще до проникновения паразита в растение, могли бы определять устойчивость или восприимчивость растения-хозяина к паразитам, обитающим в почве. Желательно, чтобы проверка сообщений о наличии специфических взаимодействий основывалась на результатах не только модельных опытов в лаборатории, но и более сложных экспериментов, проводившихся в естественных условиях в почве.

Взаимодействие с паразитами на надземных частях растений

В ранних исследованиях Брауна [128] было высказано предположение, что листья и лепестки служат источником веществ, стимулирующих или ингибирующих развитие грибов в инфекционных капельках. Было показано, что во время инкубирования на надземных частях растений в инфекционных каплях не только менялась электропроводность, но и накапливались соединения, которые влияли на прорастание спор Botrytis cinerea. На основании этих наблюдений можно предположить, что надземные органы растений, как и корни, могут влиять на поведение попадающих на их поверхность микроорганизмов. Однако в исследованиях последних лет было показано, что некоторые из этих явлений могут быть обусловлены другими организмами, находящимися на поверхности растения.

Бактерии особенно быстро размножаются в каплях воды на поверхности листа в присутствии грибных спор, и некоторые из этих бактерий продуцируют вещества, которые ингибируют прорастание грибов на листе [21]. Облучение капелек воды на листьях свеклы Beta vulgaris и Chrysanthemum sp. ультрафиолетовым светом очень высокой интенсивности не привело к снижению численности популяции бактерий [250]. Гибель таких же бактерий в контрольных капельках на предметных стеклах дает основание предполагать, что на листе они укрыты от излучения, находясь либо в межклеточном пространстве, либо под складками кутикулы. Поэтому бактерии могут существовать на поверхности листа, размножаться на ней и оказывать влияние на потенциальных паразитов растений.

Пыльцевые зерна могут быть основным источником веществ, стимулирующих прорастание спор многих грибов, в особенности некротрофных паразитов, таких, как Botrytis и Fusarium spp. Значительное влияние пыльцы было показано в экспериментах по инфицированию ягод земляники Fragaria ananassa грибом В. cinerea [38]. Когда пыльник удаляли до нанесения конидий, никакого заражения не происходило, но при наличии пыльника наблюдалось быстрое загнивание плода. Затем было показано, что пыльца и ее экстракты способствуют прорастанию конидий и инфицированию лепестков земляники и листьев конского боба. Так, выделения пыльцы способствуют проявлению вирулентности В. cinerea, который обычно авирулентен для всех цветков и листьев, за исключением стареющих. Пыльники цветков пшеницы стимулируют заражение колосков F. graminearum [244]. Тот факт, что колоски устойчивы к заражению до появления пыльников или после их удаления, позволяет предположить, что диффундирующие из них вещества стимулируют рост гриба и способствуют повышению его вирулентности на этих частях растения пшеницы. Холин и бетаин были идентифицированы как два основных химических компонента пыльника пшеницы, которые стимулируют прорастание F. graminearum [243], но пока еще не доказано, что они являются факторами, определяющими вирулентность. При благоприятной влажности и наличии инокулюма пыльник и опавшие пыльцевые зерна могут способствовать развитию определенных типов болезней. В обширных опытах по изменению микофлоры листьев ржи Secale cereale под воздействием пыльцы в естественных и искусственных условиях было показано, что она может стимулировать также развитие грибов-конкурентов и грибов-антагонистов [74, 75]. Таким образом, в полевых условиях цветение не обязательно способствует паразитизму, необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить, как оно влияет на развитие болезни.

Так как есть данные о том, что паразитические и сапрофитные грибы и бактерии взаимодействуют на поверхности листа, экология поверхности листьев признана в настоящее время важным объектом исследования [195].

На эти экологические взаимодействия может также влиять кутикула, которая состоит из многих компонентов и имеет сложную конфигурацию поверхности. Некоторые кутикулы не препятствуют прохождению молекул из нижележащих клеток, воздействуя, таким образом, на паразитов на поверхности. Другие кутилулы, как показано путем экстракции органическими растворителями, содержат фунгицидные вещества, и возможно, что именно они препятствуют паразитизму либо диффундируя в инфекционные капельки, либо воздействуя на паразита во время внедрения. Однако Мартин и Джунифер [167] в своем очень подробном обзоре о кутикулах растений пришли к заключению, что кутикула оказывает прямой ингибирующий или стимулирующий эффект на потенциальных паразитов. Они считали, что устойчивость может быть косвенно вызвана физическим воздействием на инфекционные капельки. Химический состав кутикулы может препятствовать увлажнению поверхности и сводить к минимуму сохранение влаги, влияя таким образом на внедрение паразитических грибов, большинству из которых требуется существование влажной пленки в течение нескольких часов во время прорастания и внедрения.

На внедрение паразита оказывают влияние физические свойства кутикулярного слоя и химические выделения. Так, Дикинсон [60] показал, что ростковые трубки ржавчинных грибов могут обнаруживать складки на мембранах и расти между ними и предположил, что они ведут себя так же на поверхности листа, когда определяют местонахождение устьица.

Было сделано несколько попыток оценить важность этих явлений для устойчивости. Образование аппрессориев Colletotrichum lindemuthianum обычно происходит над вертикальными стенками клеток эпидермиса, причем одинаково как у устойчивых, так и у восприимчивых сортов боба [223], что ставит под сомнение особую роль поверхности кутикулы в определении типа инфекции (табл. 4).

В опытах с позитивными репликами листьев хмеля Humulus lupulus было показано, что зооспоры Pseudoperortospora humuli способны обнаруживать местонахождение устьиц и поселяться в них, хотя и довольно медленно.

Роил и Томас [211] показали, что на свету зооспоры обладают способностью очень быстро двигаться по направлению к открытым устьицам листьев, очевидно, в ответ на химическую стимуляцию, связанную с фотосинтезом. Однако этот хемотаксис к устьицам происходил одинаково как на устойчивых, так и на восприимчивых сортах хмеля [210], что опять-таки опровергает положение об определяющей роли поверхности кутикулы в регуляции проявления вирулентности и авирулентности (табл. 5).

Совершенно ясно, что паразиты и надземные части растений прямо и косвенно взаимодействуют друг с другом, но мало данных в поддержку предположения о том, что гибель паразита часто обусловлена его неспособностью инфицировать устойчивый сорт. Однако пока относительно мало известно о гибели в природе многих паразитических микроорганизмов, попадающих на самые разнообразные листья, в благоприятных для инфекции условиях. Многие паразиты не могут проникнуть в растение из-за особенности кутикулы или содержания в ней антимикробных соединений. Экссудаты пыльцы могут играть роль в повышении восприимчивости растений к некоторым паразитам, но требуются дальнейшие интенсивные исследования, чтобы выявить общее значение этого явления для экологии поверхности листа и для паразитизма.

Связь между вирулентностью паразита и его проникновением в растения

Многие бактерии и большинство мучнисторосяных и ржавчинных грибов попадают в растение в основном или исключительно через устьица. Рядом исследователей было постулировано, что многие грибы, особенно ржавчинные, авирулентны, потому что не могут достичь устьичной щели. Аллен [5], изучая ряд сортов пшеницы, устойчивых к Puccinia graminis f. sp. tritici, получил четкое доказательство того, что растения одного из исследованных сортов в равной степени препятствовали проникновению через устьичные щели инфекционных гиф как вирулентных, так и авирулентных рас паразита. Браун и Шиптон [26] измерили у многих сортов частоту проникновений различных рас P. grminis f. sp. tritici через устьичные щели. Они выявили существенные различия между сортами по этому показателю, однако, как показано в таблице 6, эти различия не были связаны с конечным инфекционным типом. Возможно, наиболее интересным является тот факт, что у некоторых сортов проникновение происходит менее чем через 2% устьиц, контактировавших с аппрессориями, однако ржавчинные грибы могут довольно широко разрастаться, даже если одна спора успешно проникнет через устьице. Данные, полученные в этих опытах с ржавчинными грибами, противоречат предположению о том, что размер уредопустулы зависит от того, насколько активно растение препятствует внедрению паразита через устьица. Однако пока ничего не сообщалось о том, как особенности строения устьиц влияют на численность уредопустул, хотя есть данные о влиянии этого фактора на размер колоний и реакцию растения-хозяина, которая включает и тип инфекции.

На основании этих результатов можно предположить, что снижение поражаемости пшеницы ржавчиной может быть достигнуто путем выведения сортов, сочетающих эндогенные факторы устойчивости со специфическими особенностями устьичного аппарата, препятствующими внедрению паразита.

Оценить легкость преодоления кутикулы многими грибами, которые внедряются этим путем, технически очень сложно, поэтому это пытались осуществить в модельных опытах с изолированными кутикулами и искусственными мембранами в присутствии экстракта из кутикул. Магешвари, Аллен и Гильденбранд [159] выделили кутикулу из листьев Antirrhinum и установили, что аппрессории и инфекционные гифы нескольких различных ржавчинных грибов независимо от их специализации нормально прорастают и развиваются на этой кутикуле. Янг и Эллингбо [277] провели количественное исследование поведения мучнисторосяных грибов на поверхности растений-хозяев и непривычных для них злаков, в основном пшеницы и ячменя Hordeum vulgare. Грибы свободно образовывали аппрессории как на тех, так и на других растениях даже в том случае, если в растениях имеется специфический ген устойчивости к испытываемым расам грибов. Аналогичные результаты были получены при использовании изолированных кутикул, поэтому можно предположить, что конфигурация поверхности или ее химический состав не оказывает существенного влияния на устойчивость или восприимчивость. Толстая кутикула не всегда является барьером для инфекции, например, кустарник Euonymus japonicus имеет чрезвычайно толстую кутикулярную мембрану и тем не менее очень восприимчив к мучнисторосяным грибам, внедряющимся через нее [203]. Однако возраст кутикулы мака Populux tremuloides оказывал сильное влияние на способность гриба Colletotrichum gloeosporioides внедряться и осуществлять заражение [165]. Это свидетельствует о том, что некоторые кутикулы могут служить барьером для инфекции. Результаты большинства исследований, в которых проводилось количественное сравнение поведения паразита на устойчивых и восприимчивых растениях, подтверждают вывод Мартина [166] о том, что кутикула играет значительно меньшую роль в устойчивости, чем эндогенные взаимодействия, происходящие после проникновения паразита. Однако работ, в которых подробно исследуется этот вопрос, немного. Большинство грибов, которые внедряются через интактные поверхности растений, должны проникнуть сначала через кутикулу, а затем через эпидермис, исключение составляют Venturia spp. и Diplocarpon rosae, которые локализованы в растении между кутикулой и эпидермисом. Результаты, полученные при исследовании точек проникновения с помощью электронной микроскопии, проведенные, например Мак-Кином [172] при изучении Botrytis cinerea, дают основание считать, что, проникая через эпидермис, гриб оказывает на него строго локализованное ферментативное воздействие. Известно, что многие ферменты грибов могут воздействовать на различные компоненты стенок растительных клеток [276]. По-видимому, эти ферменты иммобилизованы в кончиках инфекционных гиф или выделяются ими во время первичного внедрения через стенку эпидермальных клеток. Интригующая гипотеза была выдвинута Альбершаймом, Джоунсом и Инглишем [1] для объяснения авирулентности и устойчивости на основе взаимодействия между ферментами грибов и компонентами стенок эпидермальных клеток. Она была основана, во- первых, на их наблюдении, что при росте на клеточных стенках, как единственном источнике углерода, паразитические грибы продуцируют ряд различных гидролитических ферментов и, во-вторых, на их открытии того, что клеточные стенки содержат множество различных полисахаридов. Таким образом, была постулирована последовательность взаимодействий, в ходе которых клеточная стенка оказывается устойчивой, если выделяется сахар, подавляющий синтез необходимого фермента, или неустойчивой, если этот сахар не выделяется.

Изучение аналогичных процессов индукции ферментов субстратом и их подавления катаболитом у микроорганизмов может позволить найти правильное объяснение взаимосвязи механизма устойчивости и свойствами клеточной стенки. Эта гипотеза требует доказательства, и пока неясно, почему авирулентные паразиты прекращают рост при попытке проникнуть через стенки устойчивых клеток.

Особенно противоречат ей результаты исследований Скиппа и Деверолла [223], полученные при изучении той стадии инфекционного процесса, когда авирулентные расы Colletotrichum lindemuthianum терпят неудачу в попытке паразитировать на устойчивых сортах боба (именно это взаимодействие было положено в основу модели, использованной при разработке гипотезы). Некоторые трудности возникли при решении с помощью светового микроскопа вопроса о том, когда прекращается рост гриба: до проникновения через стенку или после него, так как проявление устойчивости сопровождалось некрозом нижележащих клеток, протоплазма которых приобретала гранулярную структуру и коричневую окраску. Однако, обработав ткани раствором щелочи, удалось устранить эти помехи из мертвых клеток и обнаружить, что более чем 80% из них содержат короткие инфекционные гифы. Результаты проведенного параллельно исследования Мерсера, Вуда и Гринвуда [175] с использованием электронной микроскопии подтвердили наличие гиф внутри мертвых протопластов некоторых сверхчувствительных клеток. При сравнении поведения грибов в клетках устойчивых и восприимчивых сортов нескольких видов растений было подтверждено, что гифы обычно одинаково хорошо прорастают через первую клеточную стенку, как в случае развития Phytophthora infestans на срезанной поверхности клубней картофеля. Гифы зооспор проникали через стенки устойчивых клеток через несколько часов после инокуляции [253], но спустя еще несколько часов их рост внутри устойчивых клеток прекращался. Другая серия экспериментов была посвящена изучению той стадии инфекционного процесса, когда проявлялось действие четырех различных генов устойчивости пшеницы к Erysiphe graminis f. sp. tritici. Работая с почти синхронно развивающимися инокулюмами в контролируемых условиях окружающей среды, Слесинский и Эллингбо [226] обнаружили, что действие ни одного из генов не проявлялось ни в первые 12 ч, когда образовывались аппрессории, ни в течение нескольких последующих часов, когда образовывались первичные гаустории внутри эпидермальных клеток. Как описано в главе 3, прекращение роста гиф происходит на более поздних стадиях. Это снова указывает на то, что решающие события происходят после проникновения паразита через клеточную стенку.

Заключение

При взаимодействии с растением-хозяином неудача может постигнуть паразита уже на стадии проникновения через кутикулу и стенки эпидермиса, как это случается с Colletotrichum gloeosporioides на маке. За процессом внедрения очень трудно наблюдать и измерять его количественно. Однако в большинстве опытов по изучению ранних стадий заражения было показано, что гибель паразита происходит позднее, по крайней мере после его проникновения в первую клетку. Следует признать, что известные защитные механизмы растений срабатывают после проникновения в клетку, но необходимо еще раз напомнить здесь, что очень мало известно о гибели многих потенциальных паразитов в природе. Как отмечалось в этой главе, многие взаимодействия возможны на самых ранних стадиях паразитизма. Возможно, что в дальнейших исследованиях будет установлено, что эти взаимодействия играют более важную роль в общей защите растений, чем об этом свидетельствуют современные данные.